Teste de DNA

Teste de DNA

Os testes de DNA são atualmente o método mais seguro para a identificação de pessoas.

A eletroforese é a técnica aplicada para a identificação dos fragmentos do DNA.

O DNA (ácido desoxirribonucleico) é um dos ácidos nucleicos e pode ser encontrado tanto no interior quanto no exterior das células. Embora o DNA tenha se tornado conhecido apenas nas últimas décadas devido à popularização dos exames para identificação de paternidade duvidosa, ele já era conhecido no meio científico desde o início da década de 1950, quando ficou comprovado que o DNA é o material que constitui os genes. Através doDNA é possível identificar pessoas para esclarecer uma possível participação em um crime e também na realização de testes de paternidade. É importante lembrar que, com exceção dos gêmeos univitelinos, o DNA de cada pessoa é único.

O teste de DNA, chamado de DNA figerprint ou impressão digital genética, fornece um grau de confiabilidade bastante alto, ultrapassando 99,9% de certeza em seu resultado. Devido a isso, esse teste é muito empregado na determinação de paternidade e na resolução de crimes.

Para que haja a identificação de uma pessoa através de seu DNA são utilizadas sondas capazes de detectar sequências do DNA humano. Essas sequências de DNA são chamadas de VNTR (Variable Number of Tandem Repeats - número variável de repetições em sequência) e são compostas por sequências curtas de nucleotídeos que se repetem ao longo de trechos da molécula de DNA. Cada pessoa tem um padrão específico de repetição dessas unidades e esse padrão é herdado de seus pais.

Quando amostras de DNA são obtidas através de pelos, sangue, pedaços de pele, esperma etc., é possível o isolamento do DNA utilizando enzimas de restrição. Após o uso das enzimas, o DNA fica fragmentado, ou seja, separado em pequenos pedacinhos. Em seguida, esses pequenos pedaços são separados em um processo chamado de eletroforese, que utiliza corrente elétrica.  Após o término da eletroforese, um equipamento que utiliza luz ultravioleta e corante específico traduz a imagem do DNA, que então poderá ser estudada pelos pesquisadores.

As faixas observadas são únicas para cada pessoa e por isso ela é chamada de impressão digital de DNA ou impressão digital genética.

Células-tronco

O que são Células-tronco:

Células-tronco são células indiferenciadas capazes de autorrenovação e diferenciação, ou seja, podem duplicar-se e transformar-se em outros tipos de células.

As células-tronco podem ser induzidas ou programadas para desenvolverem funções específicas, uma vez que ainda não têm uma especialização, podendo originar tecidos em laboratório ou ainda substituir órgãos e células para tratar uma grande variedade de patologias e distúrbios humanos.

A classificação das células-tronco baseia-se nos seus respectivos potenciais de desenvolvimento. Quanto mais primitiva for a sua linha de desenvolvimento embrionário, maior é o potencial de diferenciação da célula-tronco.

Células-Tronco Embrionárias ou Totipotentes 
São as células-tronco presentes nos embriões, resultantes das primeiras divisões celulares que ocorreram após a fecundação. São capazes de se diferenciarem em qualquer tecido do organismo humano.

Células-Tronco Adultas ou Multipotentes
São células-tronco capazes de se diferenciarem em quase todos os tipos de tecidos humanos, com exceção da placenta e dos anexos embrionários.

Encontram-se, sobretudo, na medula óssea e no sangue do cordão umbilical, embora cada órgão do corpo possua um pouco de células-tronco para poder renovar as suas células ao longo da vida​.

Células-Tronco Oligopotentes
São células-tronco capazes de diferenciarem-se em poucos tecidos, sendo encontradas em diversos tecidos, como no trato intestinal, por exemplo.

Células-Tronco Unipotentes
São células-tronco que conseguem apenas diferenciarem-se num único tecido, ou seja, o tecido ao qual pertencem.

Transgênicos:

O que são os Transgênicos:

Transgênicos são organismos vivos (normalmente plantas e animais) geneticamente modificados.

Com o avanço da engenharia genética, surgiu a possibilidade de alterar o DNA de alguns seres vivos com o intuito de potencializar ou criar determinadas características que seriam inviáveis de serem produzidas pela natureza.

A modificação genética pode incluir diferentes tipos de técnicas, como a manipulação do DNA recombinante de diferentes espécies, fusão celular, hibridizações e etc.

Transgene e Trangênico

Muitas pessoas confundem estes dois termos e consideram sinônimos. Mas, mesmo estando relacionados, ambos possuem significados distintos.

Transgene se refere ao material genético extraído de determinado ser vivo e que é introduzido em outro.

Transgênico, por sua vez, se refere ao organismo que foi geneticamente modificado.

Alimentos transgênicos

O termo “transgênico” é popularmente associado aos alimentos produzidos a partir da agricultura, como vegetais, frutas e etc.

A principal finalidade da criação de alimentos transgênicos é desenvolver produtos com melhor qualidade e resistência, visando principalmente o lucro dos produtores.

Inúmeras são as possibilidades de manipulação genética na agricultura, criando desde plantas mais resistentes às pragas até alimentos mais ricos em determinados tipos de vitaminas.

Vantagens e desvantagens

A produção de produtos transgênicos, principalmente para o consumo humano, é alvo de intenso debate entre os defensores da manipulação genética e aqueles que criticam esta prática (como o Greenpeace, por exemplo), acusando-a de ser nociva à saúde.

Confira quais são os principais prós e contras dos alimentos transgênicos:

Vantagens

• Podem evitar ou prevenir o risco de pragas e doenças nas plantações;
• Aumento da produtividade e rendimentos das colheitas;
• Podem ser mais resistentes aos agrotóxicos;
• Produção de alimentos enriquecidos com mais proteínas e vitaminas específicas;
• Retirar características que podem ser nocivas para as pessoas (por exemplo: retirar a lactose presente no leite, para as pessoas que são alérgicas a este componente).

Desvantagens

• Desencadeamento de novos tipos de alergias, devido as diferentes proteínas criadas a partir da manipulação genética;
• Podem criar efeitos inesperados no produto, ou seja, os efeitos podem ser imprevisíveis;
• Podem ser produzidas substâncias tóxicas, quando há uma perda no controle da manipulação dos transgênicos;
• As alterações genéticas podem provocar sérios desequilíbrios ecológicos, afetando a cadeia alimentar de determinado ecossistema;
• Diminuição da biodiversidade.

Transgênicos no Brasil

No Brasil, de acordo com a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), todos os produtos transgênicos devem ser identificados, para que os consumidores saibam que o alimento que estão a consumir é geneticamente modificado.

Outra regra é a aprovação da Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) antes da produção e comercialização de determinado produto transgênico para a população.

Curiosidades:

https://g1.globo.com/natureza/noticia/peixe-femea-da-amazonia-se-reproduz-sem-sexo-e-desafia-teoria-de-extincao-da-especie.ghtml

Projeto Genoma

PROJETO GENOMA

No dia 14 de abril de 2003, os cientistas anunciaram a conclusão do Projeto Genoma, com a “leitura” de 99,99% do sequenciamento genético humano, ou seja, foram compiladas 3 bilhões de letras químicas do nosso DNA. Era o final de uma pesquisa que levou sete anos, envolveu milhares de pesquisadores no mundo todo e custou bilhões de dólares.

O Projeto Genoma Humano foi um trabalho internacional de pesquisa científica com o objetivo de determinar a sequência de pares de bases químicas que compõem o DNA humano e de identificar e mapear todos os genes do genoma humano a partir de um ponto de vista físico e funcional. É o maior projeto colaborativo do tipo no mundo. Suas principais aplicações estão na pesquisa do câncer e doenças genéticas raras, além de determinar quais remédios poderão ser mais eficazes de acordo com cada pessoa. Segundo pesquisadores envolvidos, os humanos possuem uma “base” idêntica de genes de 99,9%.

 O projeto Genoma Humano começou como uma iniciativa do setor público, tendo a liderança de James Watson, na época chefe dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH). Numerosas escolas, universidades e laboratórios participam do projeto.

O genoma traz codificado no DNA dos seus 46 cromossomos as instruções que irão afetar, não apenas sua estrutura, seu tamanho, sua cor e outros atributos físicos, como também sua inteligência, sua suscetibilidade a doenças, seu tempo de vida e até alguns aspectos de seu comportamento.

O padrão genético do ser humano contém aproximadamente 3 bilhões de pares de bases químicas. Decifrar o código genético é compreender as dezenas de milhares de genes que compõem o DNA humano, tarefa que necessita de muitos pesquisadores empenhados, auxiliados por máquinas de última geração – o que implica, também, recursos financeiros.

A grande meta do Projeto Genoma Humano é compreender esses mecanismos, inclusive o de doenças, para que se possa aplicar tecnologia para alterar certas instruções com vistas a garantir uma melhoria na qualidade de vida do organismo.

O Projeto Genoma Humano é um empreendimento internacional, iniciado formalmente em 1990 e projetado para durar 15 anos, com o objetivo de identificar e fazer o mapeamento dos genes existentes no DNA das células do corpo humano, determinar as sequências dos 3 bilhões de bases químicas que compõem o DNA humano e armazenar essas informações em bancos de dados acessíveis.

Paralelamente, são feitos estudos acerca do genoma de outros seres, principalmente micro-organismos (recentemente foi publicado estudos acerca do genoma do ornitorrinco). Essa linha de pesquisa é uma forma de descobrir semelhanças e facilitar o estudo em questão, considerando aspectos e mecanismos evolutivos – além de integrar outros pesquisadores e estudos que, juntos, podem ser esclarecedores.

Para o mapeamento, são feitos diagramas descritivos de cada cromossomo humano, dividindo-os em fragmentos menores, ordenando em suas respectivas posições nos cromossomos. O passo seguinte é determinar a sequência das bases de cada um dos fragmentos ordenados, a fim de descobrir todos os genes na sequência do DNA e desenvolver meios de usar esta informação para estudo da biologia e da medicina. Um mapa genômico descreve, ainda, a ordem dos marcadores e o espaçamento entre eles, em cada cromossomo.

As informações detalhadas sobre o DNA e o mapeamento genético dos organismos devem revolucionar as explorações biológicas que serão feitas em seguida, podendo causar muitas surpresas!

O Projeto Genoma Humano (PGH) foi uma pesquisa científica que contou com a participação de cientistas de 18 países.

Clonagem de DNA

Pontos Principais:

• Clonagem de DNA é uma técnica da biologia molecular para fazer muitas cópias idênticas de um pedaço de DNA, tal como um gene.
• Num experimento típico de clonagem, um gene alvo é inserido num pedaço circular de DNA chamado do plasmídeo.
• O plasmídeo é introduzido em bactérias através de um processo chamado transformação, e bactérias portadoras do plasmídeo são selecionadas utilizando-se antibióticos.
• As bactérias com o plasmídeo correto são utilizadas para produzirem mais DNA do plasmídeo ou, em alguns casos, induzidas a expressar o gene e produzir proteína.

Introdução

Quando você ouve a palavra “clonagem,” você pode pensar na clonagem de um organismo inteiro, como a ovelha Dolly. Porém, o significado de clonaralguma coisa é fazer uma cópia geneticamente exata dela. Num laboratório de genética molecular, o que é clonado com maior frequência é um gene ou um pequeno pedaço de DNA.

Visão geral da clonagem de DNA

Clonagem de DNA é o processo de fazer várias cópias idênticas de um pedaço específico de DNA. Num procedimento típico de clonagem de DNA, o gene ou outro fragmento de DNA de interesse (talvez um gene para uma proteína humana de interesse médico) é primeiramente inserido numa peça circular de DNA chamada plasmídeo. A inserção é feita utilizando-se enzimas que “cortam e colam” DNA, e produz uma molécula de DNA recombinante, ou seja, DNA montado a partir de fragmentos de várias fontes.

Diagrama mostrando a construção de uma molécula de DNA recombinante. Um pedaço circular de DNA plasmidial tem saliências em suas extremidades, que coincidem com os de um fragmento do gene. Plasmídeo e fragmento de gene são unidos para produzir um plasmídeo que contém o gene. Esse plasmídeo com o gene é um exemplo de DNA recombinante, ou de uma molécula de DNA montada a partir de DNA de várias fontes.

Em seguida o plasmídeo recombinante é introduzido em bactérias. As bactérias contendo plasmídeo são selecionadas e cultivadas. Conforme elas se reproduzem, replicam o plasmídeo e o transmitem para seus descendentes, produzindo cópias do DNA que ele contém.

Qual a finalidade de produzir várias cópias de uma seqüência de DNA num plasmídeo? Em alguns casos, precisamos de muitas cópias de DNA para realizar experimentos ou construir novos plasmídeos. Em outros, o pedaço de DNA codifica uma proteína útil, e as bactérias são usadas como "fábricas" para produção dessa proteína. Por exemplo, o gene da insulina humana é expresso em bactérias E. coli para produzir a insulina usada pelos diabéticos.

Etapas da clonagem do DNA

A clonagem do DNA é utilizada para várias finalidades.Como exemplo, vejamos como a clonagem do DNA pode ser utilizada para sintetizar uma proteína (como a insulina humana) nas bactérias. As etapas básicas são:

1. Cortar e abrir o plasmídeo e "inserir" o gene. Esse processo baseia-se em enzimas de restrição (que cortam o DNA) e na DNA ligase (que une/cola o DNA).
2. Transformar o plasmídeo em bactéria. Utilizar a seleção por antibiótico para identificar as bactérias que pegaram o plasmídeo.
3. Cultivar lotes de bactérias portadoras de plasmídeo e usá-las como "fábricas" para fazer a proteína. Colher a proteína das bactérias e purificá-la.

1. Cortando e colando DNA

Como pedaços de DNA de diferentes fontes podem ser unidos? Um método comum utiliza dois tipos de enzimas: enzimas de restrição e DNA ligase.

Um enzima de restrição é uma enzima cortadora de DNA que reconhece uma sequência alvo específica e corta o DNA em dois pedaços neste sítio ou próximo a ele. Muitas enzimas de restrição produzem extremidades cortadas com saliências curtas de fita simples. Se duas moléculas tiverem saliências correspondentes, elas podem parear bases e permanecer juntas. Contudo, elas não irão se combinar para formar uma molécula de DNA intacta até que sejam unidas pelo DNA ligase, que sela as lacunas do eixo do DNA.

[Veja o diagrama das enzimas de restrição e da DNA ligase]

Nossa meta na clonagem é inserir um gene alvo (p.e., para insulina humana) num plasmídeo. Usando uma enzima de restrição cuidadosamente escolhida, digerimos:

O plasmídeo, que tem um único local de corte

O fragmento do gene alvo, que tem um sítio de restrição (de corte) próximo a cada extremidade

Então, combinamos os fragmentos com DNA ligase, que os une para fazer um plasmídeo recombinante contendo o gene.

2. Transformação e seleção bacteriana

Os plasmídeos e outros DNA podem ser introduzidos nas bactérias, como as inofensivas E. coli utilizadas em laboratório, num processo chamado transformação. Durante a transformação, é dado um choque (por exposição a alta temperatura, por exemplo) a células bacterianas especialmente preparadas que as encoraja a incorporar DNA estranho.

O DNA produzido por ligação (que pode ser de uma mistura dos plasmídeos desejados, de plasmídeos secundários e de pedaços lineares de DNA) é adicionado às bactérias. As bactérias são submetidas a um choque térmico, que as torna mais aptas a incorporar o DNA por transformação. No entanto, apenas uma pequena minoria das bactérias vai ter sucesso em pegar um plasmídeo.

Um plasmídeo geralmente tem um gene de resistência aos antibióticos, que permite que as bactérias sobrevivam na presença de um antibiótico específico. Assim, as bactérias portadoras de plasmídeo podem ser selecionadas em placas com nutrientes contendo o antibiótico. As bactérias sem plasmídeo morrerão, enquanto bactérias portadoras de plasmídeo podem viver e reproduzir-se. Cada bactéria sobrevivente dará origem a um grupo pequeno, como um ponto, ou colônia, de bactérias idênticas em que todas carregam o mesmo plasmídeo.

Painel esquerdo: Diagrama do plasmídeo, mostrando que ele contém um gene de resistência aos antibióticos.

Painel direito: todas as bactérias da transformação são colocadas numa placa de antibiótico. As bactérias sem plasmídeo morrerão devido o antibiótico. Cada bactéria com um plasmídeo forma uma colônia, ou um grupo de bactérias clonais em que todas contêm o mesmo plasmídeo. Uma colônia típica se parece com um pequeno ponto esbranquiçado do tamanho de uma cabeça de alfinete.

Nem todas as colônias irão necessariamente conter o plasmídeo certo. Isso acontece porque, durante uma ligação, fragmentos de DNA nem sempre ficam "colados" exatamente da maneira que queremos. Em vez disso, devemos coletar o DNA de várias colonias e ver se cada uma contém o plasmídeo certo. Métodos como digestão por enzima de restrição e PCR/RCP são comumente usados para checar os plasmídeos.

3. Produção de proteína

Uma vez que encontramos uma colonia de bactérias com o plasmídeo certo, podemos cultivar uma grande cultura de bactérias portadoras do plasmídeo. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a produzir a proteína alvo.

As bactérias servem como mini "fábricas," produzindo grandes quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina humana.

Uma colônia selecionada é cultivada em uma cultura grande (por exemplo, um frasco de 1 litro). As bactérias na cultura grande são induzidas a expressar o gene contido no plasmídeo, fazendo com que o gene seja transcrito em RNAm e o RNmA seja traduzido em proteínas. A proteína codificada pelo gene acumula-se dentro das bactérias.

Uma vez que a proteína tenha sido produzida, as células bacterianas podem ser abertas para liberá-la. Existem muitas outras proteínas e macromoléculas flutuando nas bactérias além da proteína alvo (por exemplo, a insulina). Devido a isso, a proteína alvo deve ser purificada, ou separada dos outros conteúdos das células por técnicas bioquímicas. A proteína purificada pode ser usada para experimentos ou, no caso de insulina, administrada aos pacientes.

Usos da clonagem de DNA

As moléculas de DNA construídas a partir de técnicas de clonagem são utilizadas para vários propósitos em biologia molecular. Uma curta lista de exemplos inclui:

Biofarmacêuticos. A clonagem do DNA pode ser usada para produzir proteínas humanas com aplicações biomédicas, como a insulina mencionada acima. Outros exemplos de proteínas recombinantes incluem o hormônio do crescimento humano, que é ministrado a pacientes incapazes de sintetizá-lo, e o ativador de plasminogênio tecidual (tPA/ APt), que é usado para tratar derrames e prevenir coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como estas. frequentemente são produzidas em bactérias.

Terapia genética. Em algumas desordens genéticas, os pacientes não possuem a forma funcional de um gene particular. A terapia genética tenta fornecer uma cópia normal do gene para as células do corpo do paciente. Por exemplo, a clonagem do DNA foi usada para construir plasmídeos com uma versão normal do gene que é não funcional na fibrose cística. Quando os plasmídeos foram liberados nos pulmões dos pacientes com fibrose cística, a função pulmonar deteriorou menos rapidamente 

Análise genética. Em laboratórios de pesquisa básica , os biólogos geralmente usam a clonagem de DNA para construir versões artificiais, recombinantes dos genes que os ajudam a compreender como é a função normal dos genes num organismo. 

Estes são apenas alguns exemplos de como a clonagem de DNA é usada atualmente na biologia. A clonagem de DNA é uma técnica muito comum usada numa enorme variedade de aplicações de biologia molecular.

D.N.A. Recombinante

DNA Recombinante

• O que é DNA Recombinante:

DNA Recombinante são moléculas de DNA que possuem fragmentos de DNA derivados de duas ou mais fontes, geralmente de espécies diferentes. 

A clonagem molecular é a técnica central da metodologia do DNA recombinante e consiste na transferência de um gene de um organismo para outro, ou seja, a recombinação de DNA proveniente de diferentes fontes.

• Tecnologia de DNA Recombinante 

O procedimento geralmente envolve o isolamento de um gene humano com potencial terapêutico (por ex. insulina) e a introdução desse gene numa célula animal, bacteriana ou de leveduras. 

Através do uso de proteínas denominadas enzimas de restrição, são isolados genes individuais do DNA humano e inseridos em pequenos pedaços de DNA cortados com a mesma enzima, chamados plasmídeos. 

O plasmídeo recombinante é então inserido numa célula animal, bacteriana ou de levedura, num processo chamado transformação.

Os genes de resistência a medicamentos, que também se encontram no plasmídeo, selecionam as células transformadas das não-transformadas.

É então estabelecida uma população pura de células recombinantes através do processo de clonagem, onde uma única célula selecionada dará origem a uma população de clones. 

No fim do processo, espera-se que todas as células resultantes contenham uma cópia do plasmídeo portador do gene humano inserido.

Depois do gene e da célula clonada serem inseridos, as células são então induzidas a expressar o gene humano.

• Aplicações da Tecnologia do DNA Recombinante

Produção de substâncias úteis como insulina humana, hormônio​ de crescimento,vacinas, enzimas industriais;

Estudo de mecanismos de replicação e expressão gênica;

Investigação de paternidade;

Diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas;

Terapia gênica; 

Transgênicos.